Introduzione
La risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica di enorme potenza strutturale e di innumerevoli vantaggi dal punto di vista analitico. Forse il suo più grande svantaggio è la bassa sensibilità rispetto a tecniche come la spettroscopia di massa, che sono in grado di rilevare analiti nell’intervallo di concentrazione della parte per miliardo e persino della parte per trilione. Per compensare questo svantaggio, la tecnologia ha introdotto sul mercato le cosiddette criosonde, che consentono alla risonanza magnetica di entrare nel mondo dell’analisi clinica. Infatti, sempre più studi nascono dalla combinazione di entrambe le tecniche che, applicate in modo complementare, hanno portato alla comprensione di un gran numero di sistemi di origine biologica, clinica o sintetica. Il presente studio si concentra sull’applicazione di questa potente tecnica allo studio dei terreni di coltura embrionale D+2, D+3 e D+5, con l’obiettivo di prevedere la selezione degli embrioni al momento del trasferimento, che porterà direttamente a un miglioramento del tasso di impianto, di gravidanza e di nati vivi.
Obiettivi
Costruire un nuovo strumento metodologico e strumentale che combini la spettroscopia NMR e le tecniche chemiometriche di analisi multivariata per la sua applicazione nella previsione dell’impianto embrionale.
Materiali e metodi
Si tratta di uno studio multicentrico e multidisciplinare con un’elevata componente analitica, con selezione e assegnazione casuale dei terreni di coltura. Il contributo dei casi/campione è dato da cliniche di riproduzione assistita (private e pubbliche) provenienti da punti geografici equidistanti, che forniscono una dimensione del campione di oltre 500 casi/campione, nonché un’ampia gamma di età e razze, che genererà un’elevata variabilità del campione. I terreni utilizzati per lo sviluppo embrionale sono stati quelli usuali nella pratica clinica di qualsiasi centro di riproduzione assistita umana, sia per la coltura o lo sviluppo embrionale con terreni sequenziali che con terreni one-step. La qualità del pre-embrione è determinata dalla visualizzazione delle sue caratteristiche morfologiche, con l’impianto più elevato associato allo stadio di blastocisti. Il terreno di coltura, privo di pre-embrioni, dopo il periodo di incubazione (D+2: 43-45 ore post-inseminazione; D+3: 67-69 ore post-inseminazione; D+5: 114-118 ore post-inseminazione e/o D+6: 136-140 ore post-inseminazione), viene accuratamente raccolto (20uL) e trasferito in crioviali a -80°C. Per le misure NMR, si aggiungono 400 uL di soluzione di NaCl (0,09%) in D2O a ciascuna crioviale. Le misure sono state eseguite su uno spettrometro Bruker Avance III 600 dotato di una quadrupla criosonda e utilizzando la sequenza 1H CPMG. La caratterizzazione del mezzo di coltura è stata possibile dopo l’acquisizione di esperimenti TOCSY, COSY, HMQC e HMBC mono e bidimensionali. Gli spettri ottenuti sono stati elaborati con il software TOPSPIN 3.2 (Bruker BioSpin GmbH) e quindi sottoposti ad analisi statistica con il software SIMCA-P (v. 14.0, Umetrics). Infine, sono state applicate ai dati NMR diverse tecniche di analisi multivariata non supervisionata e supervisionata, come PCA, PLS, OPLS, per l’identificazione di metaboliti discriminanti (biomarcatori) dello sviluppo embrionale, della qualità dell’embrione e della gravidanza.
Risultati
Risultati: dopo l’applicazione di un modello OPLS-DA (Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis) ai dati NMR (Figura 1), è stata osservata una discriminazione tra colture embrionali che hanno generato una gravidanza positiva (blu) e negativa (verde). Il grafico dei carichi permette di osservare le aree spettrali contenenti i metaboliti presenti in maggiore concentrazione nei campioni di colture embrionali che hanno generato una gravidanza positiva (blu) o negativa (verde). I punti verdi e blu nel grafico dei carichi mostrato nella Figura 1b indicano le regioni spettrali che causano la differenziazione e dalla cui identificazione strutturale si otterranno i biomarcatori o i metaboliti discriminanti.
Conclusioni
Lo studio preliminare fornisce una buona classificazione dei terreni di coltura dei pre-embrioni coltivati sia a D+2 che fino allo stadio di blastocisti (D+5/D+6), il che ci permette di essere ottimisti sulla possibilità di ottenere un solido modello di previsione pre-impianto con efficacia verificata. In futuro si prevede l’aggiunta di nuovi casi allo studio, che consentirà di ottenere un modello più robusto e una classificazione più accurata dei biomarcatori metabolici associati a una gravidanza positiva che migliorerà il tasso di efficienza delle tecniche di FIV e soprattutto il numero e la qualità delle blastocisti ottenute.
AUTORI: A. C. Ralha de Abreu , C. González Navas, A. Gómez García, I. Fernández, M. A. Vilches Ferrón
