Introducción: La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es una técnica de tremendo poder estructural y de innumerables ventajas desde un punto de vista analítico. Quizás su mayor desventaja es su baja sensibilidad cuando se compara con técnicas como la espectroscopía de masas que son capaces de detectar analitos en el rango de concentración de la parte por billón e incluso la parte por trillón. Para suplir esta cierta desventaja, la tecnología ha puesto en el mercado las denominadas criosondas, que permiten a la RMN introducirse en el mundo analítico clínico. De hecho, cada vez más estudios surgen de la combinación de ambas técnicas que aplicadas de forma complementaria ha supuesto el entendimiento de un gran número de sistemas tanto de origen biológico, clínico o sintético. El presente estudio se centra en la aplicación de esta potente técnica al estudio de medios de cultivo embrionario D+2, D+3 y D+5, con el objetivo de predecir la selección embrionaria, en el momento de la transferencia, que directamente supondrá una mejora en la tasa de implantación, embarazo y tasa de RNV (recién nacido vivo).
Objetivos: Construir una nueva herramienta metodológica e instrumental que combine la espectroscopía de RMN y técnicas quimiométricas de análisis multivariante para su aplicación en predicción de la implantación embrionaria.
Materiales y métodos: Es un estudio multicéntrico y multidisciplinar con una elevada componente analítica, con una selección y asignación aleatoria de los medios de cultivo. La aportación de los casos/muestra es realizada por clínicas de reproducción asistida (privado y públicos) de puntos geográficos equidistantes, aportando un tamaño muestral superior a 500 casos/muestra, así como un amplio abanico de edades y razas, generará una alta variabilidad muestral. Los medios utilizados para el desarrollo embrionario han sido los habituales utilizados en la práctica clínica de cualquier centro de reproducción asistida humana, pero tanto para cultivo o desarrollo embrionario con medios secuenciales como con medios únicos (one-step). La calidad del preembrión se determina por visualización de las características morfológicas del mismo, asociando la mayor implantación, al estadio de blastocisto. El medio de cultivo, libre del preembrión, tras periodo de incubación (D+2: 43-45 horas posinseminación; D+3: 67-69 horas posinseminación; D+5: 114-118 horas posinseminación y/o D+6: 136-140 horas posinseminación), se recoge minuciosamente (20uL) y se transfiere a crioviales a -80 ºC. Para las medidas de RMN, se añade a cada criovial la cantidad de 400 uL de una solución de NaCl (0.09%) en D2O. Las medidas se llevan a cabo en un espectrómetro Bruker Avance III 600 equipado con criosonda cuádruple y utilizando la secuencia 1H CPMG. La caracterización del medio de cultivo ha sido posible tras la adquisición de experimentos mono y bidimensionales tipo TOCSY, COSY, HMQC y HMBC. Los espectros obtenidos se procesaron a través del software TOPSPIN 3.2 (Bruker BioSpin GmbH) y luego se someten a análisis estadístico utilizando el software SIMCA-P (v. 14.0, Umetrics). Finalmente, diversas técnicas de análisis multivariante de datos no supervisadas y supervisadas tales como PCA, PLS, OPLS fueron aplicadas sobre los datos de RMN para la identificación de los metabolitos discriminantes (biomarcadores) de desarrollo y calidad embrionaria y de embarazo.
Resultados: Tras la aplicación de un modelo OPLS-DA (Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis) a los datos de RMN (Figura 1) se ha observado una discriminación entre cultivos de embriones que han generado embarazo positivo (azul) y embarazo negativo (verde). Elgráfico de loadings permite observar las zonas espectrales que contienen metabolitos que existen en mayor concentración en las muestras de cultivos de embriones que han generado embarazo positivo (azul) o negativo (verde). Los puntos verdes y azules del gráfico de loadings mostrado en la Figura 1b, muestra las regiones espectrales causantes de la diferenciación y de cuya identificación estructural se obtendrán los biomarcadores o metabolitos discriminantes.
Conclusiones: El estudio preliminar arroja una buena clasificación de medios de cultivo de preembriones cultivados tanto a D+2 como hasta estadio de blastocisto (D+5/D+6) que permite ser optimista en cuanto a poder obtener un modelo de predicción preimplantacional sólido y de eficacia verificada. En el futuro se prevé la adición de nuevos casos al estudio, que permitirán la obtención de un modelo más robusto y de una clasificación más exacta de los biomarcadores metabólicos asociados a un embarazo positivo que mejorará la tasa de eficiencia de las técnicas de FIV y en especial el número y calidad de los blastocistos obtenidos.
AUTORES: A. C. Ralha de Abreu , C. González Navas, A. Gómez García, I. Fernández, M. A. Vilches Ferrón
